Forschungspublikationen

Abstract

Ziel dieser Studie ist die Herstellung von Nanofaservliesen mit einer stark dreidimensionalen Struktur. Dazu werden im Lösungsmittelelektrospinnen Kollektor Geometrien variiert und Proben Nachbehandlungsmethoden erarbeitet.

Der erste Teil dieser Studie umfasst die Reproduktion und Evaluation von bereits veröffentlichten Strategien zum Herstellen von dreidimensionalen Nanofaservlies Strukturen. [DMC+10] Aus diesen Versuchen werden modifizierte Kollektoren und Spinnvorgänge hergeleitet, welche konsistentere Ergebnisse und vereinfachte Versuchsaufbauten darstellen. Des Weiteren wurden auch Methoden zur Nachbehandlung von frisch gesponnenen Proben evaluiert und entwickelt. Diese Proben wurden in der Analyse auf Fasermorphologie, Gleich-mäßigkeit ihrer Dicke, Porengrößenverteilung und Porosität untersucht. Eine Analyse von REM-Bildern wurde unternommen um strukturelle Defekte zu erkennen.

Es wurden zwei zentrale Methoden zur Herstellung dreidimensionaler Nanofaservliese entwickelt, von denen eine Methode in der Lage ist bereits gesponnene Vliese um das mehrfache ihrer Dicke zu expandieren. Stabile Spinnparameter wurden zu allen Methoden gefunden, jedoch resultierten in allen Fällen Mikrofasern.

1. Einleitung

Weltweit leiden jedes Jahr Millionen von Menschen an schweren Verletzungen, genetischen Defekten und Krankheiten. Diese Ursachen können dazu führen, dass Patienten in ihrer Funktion eingeschränkt sind oder ihre Organe nicht mehr richtig funktionieren. Um die Symptome zu beheben oder die Funktion der geschädigten Organe wiederherzustellen, ist in vielen Fällen eine Implantation erforderlich. Eine solche Implantation wird derzeit mit Spenderorganen von menschlichen Spendern (Allografts), von Tieren (Xenografts) oder mit synthetischen Prothesen durchgeführt. Diese Implantate sind jedoch mit Einschränkungen verbunden. Allografts erfordern menschliches Spendergewebe, das nur in begrenzter Menge zur Verfügung steht und aufgrund der Variabilität des Gewebes selbst nicht universell geeignet ist. Xenotransplantate hingegen können in ihren physikalischen Eigenschaften nicht kontrolliert werden, sind ebenfalls nur begrenzt verfügbar und haben zudem eine kurze Lebensdauer, wenn sie implantiert werden. Und schließlich werden synthetische Prothesen häufig vom Immunsystem der Patienten abgestoßen. [Has17]

Um diesem Mangel abzuhelfen, entstand in den frühen 1980er Jahren das Tissue Engineering (TE), ein neuer Bereich der Biowissenschaften und der Medizintechnik. TE zielt darauf ab, das Problem der Verfügbarkeit von Spendergewebe zu lösen, indem das Ersatzgewebe unter Laborbedingungen künstlich gezüchtet wird. Bei der TE werden zunächst Zellen des geschädigten Gewebetyps auf ein Gerüst ausgesät, das der Morphologie des gewünschten Organs/Gewebes ähnelt. Ein solches Gerüst kann künstlich aus natürlichen oder synthetischen Polymeren (wie z.B. Polycaprolacton) hergestellt werden und bietet Bindungsstellen und Hohlräume, in denen die Zellen wachsen können. Um dann die Zellen zu vermehren und ihr Überleben zu sichern, müssen eine ausreichende Masse und der Nährstofftransport in vitro simuliert werden. Daher werden Bioreaktoren verwendet, die den Transport von Nährstoffen und Gasen durch das Gerüst ermöglichen und auch mechanische Stimuli liefern können. Gerüste spielen eine Schlüsselrolle in der TE, da sie ein Substrat für die Aussaat und das Wachstum von Zellen bieten und dem gezüchteten Gewebe mechanische Integrität verleihen. Gerüste können aus vielen Materialien mit unterschiedlichen Methoden hergestellt werden; ihr gemeinsames Ziel ist es jedoch, die natürliche extrazelluläre Matrix (EZM) genau nachzuahmen. Die EZM ist eine dreidimensionale Struktur aus nanoskaligen faserähnlichen Proteinen, Strukturmolekülen und Klebstoffmolekülen, die ein in-vivo-Gerüst für Zellen bildet. Zur Herstellung solcher Nanofasern kann das Elektrospinnen verwendet werden, da es die einfache Herstellung von nanoskaligen Fasern mit einer sehr anpassungsfähigen Fasermorphologie ermöglicht. Durch Änderung der Spinnparameter können der Faserdurchmesser, die Porengröße und auch die Ausrichtung der Fasern beeinflusst werden, was zur Herstellung von Gerüsten für bestimmte Gewebetypen genutzt werden kann. [BTA+11; BK10]

2. Materialien und Methoden

Das für alle Versuche verwendete Polycaprolacton (PCL) wird als geschreddertes Granulat gewonnen, das unter dem Markennamen Purasorb PC12 von Corbion N.V. (Amsterdam, Niederlande) verkauft wird. Dieses PCL-Granulat ist von medizinischer Qualität und hat ein mittleres Molekulargewicht von 114,14 g/mol. Als Lösungsmittel zur Herstellung der Spinnlösung wurden Chloroform und Methanol verwendet. Chloroform wird von der Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe, Deutschland) mit einer Reinheit von ≥99 % und einer molaren Masse von 119,38 g/mol. Das Methanol wird von der VWR International GmbH (Darmstadt, Deutschland) mit einer Reinheit von ≥98,5 % und einer Molmasse von 32,04 g/mol geliefert.

Für Experimente, bei denen ein Trockeneiskollektor oder ein Flüssigkeitskollektor verwendet wird, werden Trockeneis, Ethanol und Spülmittel verwendet. Für trockeneisgekühlte Experimente wird Trockeneis in Blockform von der TBS GmbH (Aachen, Deutschland) bezogen. Für Experimente, bei denen Flüssigkollektoren verwendet werden, wird Ethanol von Sigma-Aldrich Chemie GmbH (St. Louis, Missouri, USA) mit einer Reinheit von ≥99 % und einer molaren Masse von 46,07 g/mol geliefert. Für Experimente, bei denen Wasser als Flüssigkollektor verwendet wird, wird Spülmittel unter der Bezeichnung Alio "Ultra classic" von der DALLI-WERKE GmbH & Co. KG (Stolberg, Deutschland) verkauft wird, als Tensid verwendet.

Alle Elektrospinnverfahren werden mit einer kommerziellen Elektrospinnmaschine des Typs LE-500 von BIOINICIA SL (Paterna, Spanien) durchgeführt. Die verwendeten Kollektoren werden in Kapitel 5.2, Vorversuche, beschrieben und dargestellt. Abb. 4.1 zeigt einen Überblick über die Maschine. Der Aufbau besteht darin, den Tisch der Maschine mit einem Styropor-Isolator und einer chemikalienbeständigen Kunststoffmatte vorzubereiten. Dadurch wird der Tisch während der Versuche von elektrischen Ladungen isoliert und sichergestellt, dass nur die vorgesehenen Kollektoren auf dem Tisch Hochspannung erhalten.

2.1 Morphologie der Fasern

Zur Bestimmung des Faserdurchmessers wird ein optisches Lichtmikroskop der Serie DM4000 M von Leica Microsystems GmbH (Wetzlar, Deutschland) verwendet. Die Proben werden mit Durchlicht- oder Koaxialbeleuchtung gemessen. Um Daten zum Faserdurchmesser zu erhalten, werden für jede Probe drei verschiedene Fasern gemessen. Für diese Messungen wird die Software "Leica Application Suite Version 3.8" (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland) verwendet. Aus diesen Daten werden für jeden Probentyp ein mittlerer Faserdurchmesser und eine Standardabweichung berechnet.

2.2 Gerüstdicke und Gleichmäßigkeit

Für zuverlässige Messungen wurde ein Messgerät entwickelt, siehe Abb. 4.3. Es besteht aus einem Aluminiumrahmen mit befestigten Kunststoffplatten, von denen eine als Hintergrund dient und Millimeterpapier als Referenz verwendet wird. Der Rahmen dient als Kameraauflage und gewährleistet die parallele Ausrichtung mit der Hintergrundplatte. Die Proben werden an einer Krokodilklemme aufgehängt und mit einem Seitenanschlag für eine genaue Messung positioniert. ImageJ wird zur Verarbeitung der Probenbilder verwendet, wobei der Maßstab des Geräts als Größenreferenz dient. Für jede Probe werden zwei Messreihen durchgeführt, die jeweils aus drei Punkten bestehen, wie in Abb. 4.4 dargestellt. Der erste Satz bewertet die gesamte Probe, wobei 10 % von jedem Rand ausgeschlossen werden. Dies dient dazu, große Abweichungen zu vermeiden, da die Probenränder oft unregelmäßig geformt sind. Die verbleibende Länge wird in vier Abschnitte unterteilt, von denen drei gemessen werden. Der zweite Satz konzentriert sich auf einen 20 mm langen Abschnitt des breitesten und gleichmäßigsten Bereichs der Probe, an dem drei Messungen vorgenommen werden. Aus diesen Messungen lassen sich die durchschnittliche Dicke und die Standardabweichung berechnen, die als Indikatoren für die Gleichmäßigkeit der Probe dienen.

2.3 Porosität

Die Quantifizierung der Porosität erfolgt mit Hilfe von Micro-CT-Scans, die in GeoDict (Simulationssoftware für digitale Materialforschung und -entwicklung, Math2Market GmbH, Kaiserslautern, Deutschland) analysiert werden. Abb. 4.5 zeigt solche Scandaten und ein Modell in GeoDict. Aus jedem Satz von sechs Proben werden drei gleichmäßigere Proben auf der Grundlage von Dicken- und Gleichmäßigkeitsmessungen ausgewählt, wie in Kapitel 4.5.1 beschrieben. Die verbleibenden drei Proben jedes Satzes werden einer SEM-Analyse unterzogen.

Während der Mikro-CT-Scans werden die Proben in einer Halterung befestigt, um Bewegungen zu verhindern. Die Probe wird mit Röntgenstrahlen bestrahlt, während der Halter langsam rotiert. Der Scan erzeugt eine REK-Datei und Querschnittsbilder, die zur Visualisierung der 3D-Daten in GeoDict hochgeladen werden. In GeoDict definieren die Benutzer eine Hohlraumreferenz im 3D-Modell, die es dem Programm ermöglicht, das Volumen aller Poren zu identifizieren und zu berechnen. Durch den Vergleich des Gesamtvolumens mit dem Hohlraumvolumen gibt das Programm den prozentualen Anteil des Hohlraums am Fasermaterial aus, der als Porosität bezeichnet wird.

​​​​​​​2.4 Porengrößenverteilung

Für die Analyse der Porengrößenverteilung wird ein Porometer verwendet. Die Tests werden in zwei Schritten durchgeführt, zuerst mit der trockenen Probe und dann mit der gleichen Probe nach Befeuchtung mit Topor von Topas GmbH (Dresden, Deutschland). Bei der Nassprüfung wird der Bubble-Point bestimmt, der zur Berechnung des Porendurchmessers herangezogen wird. Die Porengrößenverteilung, einschließlich der mittleren Porengröße, der Standardabweichung und des Medians, wird in einer Excel-Tabelle erstellt.

​​​​​​​2.5 Rasterelektronenmiskroskop (REM)

Zur qualitativen Analyse größerer Bereiche der Probe sowie zur Erkennung von strukturellen Unregelmäßigkeiten in den Proben wird ein Rasterelektronenmikroskop verwendet. Darüber hinaus ermöglicht die REM-Bildgebung die Erkennung von Veränderungen in der Gesamtstruktur der Proben, die nach dem Schleudern im Vakuum behandelt wurden. Ähnlich wie die Porometerprüfung ist dieser Test zerstörend, daher werden nur drei Proben aus jedem Satz von sechs verwendet.

Um die Proben zu prüfen, werden sie mit Gold beschichtet. Die so vorbereiteten Proben werden in das REM gelegt, und die Bildgebung wird mit der REM-Kavität unter Vakuum gestartet. Die daraus resultierenden Bilder können einen relativ großen Bereich der Proben darstellen, ohne dass die Tiefenschärfe wie bei optischen Mikroskopen eingeschränkt ist. So kann die 3D-Struktur großer Teile der Proben in nur einem Bild dargestellt werden. Dies ermöglicht die Erkennung von Schäden in der Probenstruktur und eine qualitative Bewertung der Probenqualität.

3. Ergebnisse

Lösungs- und Scaffold-Eigenschaften

Zur Herstellung der Elektrospinnlösung wird das hygroskopische PCL-Polymer 24 Stunden lang in einem Vakuumofen bei 40 °C und 50 mbar Druck getrocknet. Die erforderliche Polymermasse (4,257 g) wird anhand der angegebenen Gleichung für eine 20-ml-Lösung mit 14 Gew.-% PCL ermittelt. Das Lösungsmittel, eine 3:1-Mischung aus Chloroform und Methanol, wird mit einem Magnetrührer in den mit dem Polymer gefüllten Kolben gegeben. Nach 24 Stunden auf einer Magnetrührerplatte wird die Lösung visuell auf ungelöstes Polymer untersucht. Ist dies nicht der Fall, kann die Lösung für Elektrospinnversuche verwendet werden. Es wurden mit Hilfe von 2 verschiedenen Elektrospinnmethoden, Vliese aus PCL hergestellt welche eine Dicke von 0,5 mm weit überschreiten.

Bei den zwei Methoden handelt es sich um folgende:

• Elektrospinning mit einem Flüssigkeitsbadkollektor 
• Elektrospinning auf einem mit Trockeneis versetztem Kollektor (Kryogenisch)

Für den Bau eines Flüssigkeitsbadkollektors mit einer aufgehängten Elektrode wird Aluminiumfolie verwendet, da sie leicht zugänglich ist und leicht verändert werden kann. Der Durchmesser des Becherglases wird gemessen und ein Kreis aus der Aluminiumfolie geschnitten, wobei 5 mm abgezogen werden, um einen Spalt zwischen der Elektrode und den Becherwänden zu schaffen. Zwei Streifen Alufolie werden mit Heftklammern an dem kreisförmigen Ausschnitt befestigt. Diese Streifen werden für den Anschluss an die Stromversorgung verwendet. Die Elektrode wird in das Becherglas gelegt, 15 mm über dem Boden positioniert und mit Klebeband sicher befestigt. Die Streifen werden über die Ränder des Bechers gefaltet, entlang der Außenseite des Glases geformt und unterhalb des Bechers mit Heftklammern befestigt. An der Verbindungsstelle wird eine Krokodilklemme für den Anschluss an die Hochspannungsversorgung angebracht. Dieser Aufbau wird in folgender Abbildung dargestellt.

s. Abbildung 3.1 Flüssigkeitskollektor mit eingetauchter Elektrode und REM-Aufnahme des damit hergestellten Gerüsts

Für den Bau eines Trockeneiskollektors wird eine Platte aus rostfreiem Stahl gewählt, weil sie korrosionsbeständig ist und sich für die Medizintechnik eignet. Die Platte wird in ein 12 cm langes Quadrat geschnitten und an einer Ecke wird ein Bolzen angeschweißt. An den Bolzen wird dann eine Krokodilklemme für den Anschluss an die Hochspannungsversorgung angebracht. Diese Platte wird während des Spinnvorgangs direkt auf einen Trockeneisblock gelegt. Dieser Aufbau wird ebenfalls in der folgenden Abbildung dargestellt.

s. Abbildung 3.2 Kryogener Flachkollektor und REM-Aufnahme des damit hergestellten Gerüsts

Die Bewertung der Fasermorphologie erfolgt durch drei Messungen pro Probe mit einem optischen Mikroskop. Bei sechs Proben pro Spinnverfahren ergibt dies insgesamt 18 Messungen für jeden Probentyp. Der mittlere Faserdurchmesser und die Standardabweichung für jedes Herstellungsverfahren sind in Abb. 3.3 dargestellt.

s. Abbildung 3.3 Mittlere Faserdurchmesser gruppiert nach Probentyp, einschließlich Standardabweichung

 

Bei der Auswertung der Daten wird deutlich, dass das Ziel, Faserdurchmesser ≤1 μm zu erreichen, nicht erreicht wurde. Bei allen Spinnverfahren wurde dieses Ziel um etwa das 2- bis 3-fache übertroffen, was darauf hindeutet, dass die alleinige Anpassung des Abstands zwischen Düse und Kollektor unzureichend war. Um dieses Problem zu lösen, werden iterativ Anpassungen der Spinn- und Lösungsparameter untersucht, die das Potenzial haben, mit den getesteten Produktionsmethoden Fasern in Nanometergröße herzustellen.

Die Dicke der Vliese und ihre Gleichmäßigkeit werden in Boxplots dargestellt. Jeder Probentyp umfasst 18 Messungen pro Messart. Die Linien in den Diagrammen zeigen den Bereich der Probendicke mit den maximalen und minimalen Werten an. Für die Verwendung von Tissue-Engineering (TE)-Gerüsten liegt der Schwerpunkt jedoch auf den Kästchen, die den Größenbereich von 50 % der Dickenwerte pro Probentyp darstellen. Kleinere Kästchen zeigen eine bessere Gleichmäßigkeit der Probe an, da die Hälfte der Dickenmessungen in einen engen Bereich fällt.

s. Abbildung 3.4 Boxplot der Dickenmessungen nach Messart 1 (gesamte untersuchte Probe)

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass alle Proben die geforderte Dicke von ≥1 mm übertreffen, wobei die geringste beobachtete Dicke dieses Ziel um das Vierfache übertrifft. Kryogen hergestellte Proben weisen eine überragende Gleichmäßigkeit auf, wobei 50 % der Dicken innerhalb eines Bereichs von 0,5 mm liegen. Im Gegensatz dazu weisen andere Produktionsmethoden eine weniger gleichmäßige Verteilung auf, was sie für die Verwendung als TE-Gerüst weniger geeignet macht.

Porosität und Porengrößenverteilung der Testproben sind als Balkendiagramme mit Standardabweichungen dargestellt. Für jede Produktionsmethode wurden drei Proben getestet.

Porosität:

Die Analyse der Porositätsdaten in Abb. 2.5 zeigt, dass die Trockeneis Proben den Porenanteil der im Flüssigkeitsbad hergestellten Proben deutlich erhöht hat, und zwar um das ungefähr Dreifache. Allerdings erreicht keine der Proben die angestrebte Porosität von ≥85 %, wobei der höchste Wert bei einer Trockeneis Probe mit 31,70 % beobachtet wurde. Dies könnte Auswirkungen auf die Verwendung der Proben als TE-Gerüste haben, da die Porosität für die Anhaftung, die Permeation und das Wachstum von Zellen innerhalb des Gerüsts entscheidend ist.

s. Abbildung 3.5 Mittlere Porosität der Proben, gruppiert nach Typ, einschließlich Standardabweichung

Porengrößenverteilung:

Bei der Bewertung der Porengrößenverteilung mit einem Porometer wurde festgestellt, dass die Produktionsmethoden nur minimale Auswirkungen auf die Porengrößen der Proben hatten. Dies wird in Abb. 2.6 deutlich, wo sich die Linien, die die Standardabweichung darstellen, für fast alle Proben überschneiden. Die einzige Ausnahme ist eine Probe, die mit einem Flüssigbadkollektor hergestellt wurde; der zu große Variationskoeffizient dieser Probe (Standardabweichung im Vergleich zum Mittelwert) deutet jedoch auf Unzuverlässigkeit hin und sollte beim Vergleich von Proben und Methoden außer Acht gelassen werden. Keine der Proben mit einem guten Variationskoeffizienten konnte die angestrebte Porengröße von 20 bis 30 μm erreichen, was eine mögliche Einschränkung für die Zellpermeation in TE-Anwendungen darstellt.

s. Abbildung 3.6 Mittlere Porengrößen gruppiert nach Probenart, einschließlich Standardabweichung

Nichtsdestotrotz überschreiten die Porengrößen von ± 5 μm die standardmäßigen Porengröße von eketrogesponnenen PCL Nanofaservliese von ± 3 μm. Darauf aufbauend können iterativ Änderungen im Elektrospinnprozess vorgenommen werden, um die Porengröße der erstellten PCL Vliese zu vergrößern.

Literaturliste

[BK10]           Bhardwaj, Nandana; Kundu, Subhas C.
Electrospinning: a fascinating fiber fabrication technique
Biotechnology advances. Bd. 28 (2010) H. 3, S. 325–347

[BTA+11]      Blakeney, Bryan A.; Tambralli, Ajay; Anderson, Joel M.; Andukuri, Adinarayana; Lim, Dong-Jin; Dean, Derrick R.; Jun, Ho-Wook
Cell infiltration and growth in a low density, uncompressed three-dimensional electrospun nanofibrous scaffold
Biomaterials. Bd. 32 (2011) H. 6, S. 1583–1590

[DMC+10]    Da Alves Silva, M. L.; Martins, A.; Costa-Pinto, A. R.; Costa, P.; Faria, S.; Gomes, M.; Reis, R. L.; Neves, N. M.
Cartilage tissue engineering using electrospun PCL nanofiber meshes and MSCs
Biomacromolecules. Bd. 11 (2010) H. 12, S. 3228–3236

[Has17]         Hasan, A. (Hrsg.)
Tissue engineering for artificial organs. - Weinheim: Wiley-VCH, 2017

 

 

Abstract

In dieser Studie wird Genipin zur Vernetzung von Nanofasern verwendet, die aus einer Lösung von Chitosan und Polyethylenoxid (PEO) (Verhältnis 7:3) in 70 %-iger Essigsäure elektrogesponnen wurden. Genipin ist eine chemische Verbindung, die aus den Früchten der gardenis jasminoides ellis isoliert wird und mit freien Aminogruppen reagiert. Außerdem ist es 5.000 bis 10.000 Mal weniger zytotoxisch als Glutaraldehyd, der bisher am häufigsten verwendete Vernetzer für Chitosan. [SHH+99] Untersucht werden die Fasermorphologie, die mechanische Festigkeit, das Ergebnis der Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR) und die Löslichkeit in einer wässrigen Lösung mittels gravimetrischer Messungen.

Es wurden erfolgreich Nanofasern hergestellt und dann teilweise mit Genipin vernetzt und die Vernetzung war erfolgreich. Ohne Vernetzung lösten sich die Fasern in wässriger Lösung auf, während vernetzte Fasern stabil gequollen sind. Nicht vernetzte Fasern haben einen Faserdurchmesser von 573 ± 81 nm, vernetzte 560 ± 96 nm. Nach dem Quellen betragen die Faserdurchmesser 901 ± 105 nm.

1. Einleitung

Mit einer hohen spezifischen Oberfläche, einer hohen Porosität und einer ähnlichen Größe wie die extrazelluläre Matrix (ECM) im menschlichen Körper haben elektrogesponnene Nanofasern vorteilhafte Eigenschaften für medizinische Anwendungen und Tissue Engineering [KC17]. Chitosan ist ein natürliches Biopolymer mit guter Biokompatibilität und biologischer Abbaubarkeit und weist ebenfalls Ähnlichkeiten mit der ECM auf. Nanofasern aus Chitosan wurden in der Vergangenheit bereits elektrogesponnen, welche in wässrigen Lösungen schlechte Eigenschaften (mechanische Festigkeit, Anfälligkeit für enzymatischen Abbau, Auflösen) zeigen. Die Vernetzung führt zur Kopplung von funktionellen Gruppen im Chitosan und damit zu einer Stabilisierung des Polymers, wodurch die oben genannten Einschränkungen in wässrigen Lösungen verringert werden. Der am häufigsten verwendete Vernetzer für Chitosan ist Glutaraldehyd, der eine sehr hohe Zytotoxizität aufweist und brüchige und schwächere Fasern erzeugt. [SHH+99] Ein weniger zytotoxischer Vernetzer ist Genipin, das bereits zur Vernetzung von Kollagen und Gelatine für medizinische Anwendungen verwendet wird. Genipin reagiert mit den freien Aminogruppen des Chitosans und erhöht die Stabilität in flüssigen Medien. [MFS+14]

Chitosan als natürliches Polymer unterliegt Schwankungen in der Materialqualität und im Molekulargewicht. Lösungen von Chitosan enthalten unlösliche Teile und Partikel, die einen Einfluss auf den Spinnprozess oder die gesponnene Nanofaser haben können. Daher wird in der vorliegenden Arbeit die Lösung filtriert und der Einfluss des Filtrationsprozesses auf den Spinnprozess, die Fasermorphologie und die mechanischen Eigenschaften bewertet. Außerdem wird der Einfluss von Genipin auf die Fasermorphologie und den Vernetzungserfolg untersucht.

2. Materialien und Methoden

Die Chitosan/PEO-Nanofasermembranen werden im Elektrospinnverfahren mit einer Anlage vom Typ Fluidnatek LE500 (Bioinicia SL, Valencia, Spanien) hergestellt. Für das Elektrospinnen und die Herstellung der Nanofasermembranen werden Chitosan (Molekulargewicht 100 - 300 kDa, Acros Organics, Geel, Belgien), Polyethylenoxid (900 kDa, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland), Essigsäure (99,9 %), phosphatgepufferte Salzlösung (PBS), Ethanol (≥ 99,8 %, vergällt, alle Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland) und Genipin (Enzo Life Sciences GmbH, Lörrach, Deutschland) verwendet. Alle Chemikalien werden wie geliefert und ohne weitere Aufreinigung verwendet.

Die Fasern werden aus einer Lösung mit einer Massenkonzentration von 1,2 Gew.-% Chitosan und 2,8 Gew.-% PEO in 70 %-iger Essigsäure gesponnen. Chitosan und PEO werden getrennt voneinander unter ständigem Rühren 12 Stunden lang in dem genannten Lösungsmittel gelöst. Die Lösungen werden im genannten Verhältnis gemischt und 2 Stunden lang unter ständigem Rühren homogenisiert. Zur Vernetzung von Chitosan nach dem Spinnprozess wird der Lösung vor dem Spinnen Genipin zugesetzt. Es wird ein Verhältnis von Chitosan zu Genipin von 100:1 verwendet, und das Genipin wird separat in Ethanol unter ständigem Rühren 2 Stunden lang gelöst und dann zur Chitosan/PEO-Lösung hinzugefügt. Zur Filtration der Lösung werden Einwegspritzenfilter (Chromafil Xtra GF/ PTFE-45/25, Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) verwendet.

Zur Vorbereitung des Spinnvorgangs wird die Spinnlösung in eine 5 mL Spritze (B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland) gefüllt, die an eine einzelne Spinndüse angeschlossen ist. Die Polymerlösung wird mittels Spritzenpumpe mit einer Flussrate von 1 mL/h durch eine Hohlnadel mit einem Durchmesser von 0,4 mm (B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland) extrudiert. Bei einer Spannung von +20 kV und -1 kV wird die Polymerlösung zu Fasern verstreckt und auf einer rotierenden Welle (Ø = 30 mm, Breite = 300 mm) mit einer Rotationsgeschwindigkeit von 100 U/min gesammelt. Der Spinnprozess wird bei 23 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 30 % r.F. durchgeführt.

Das Waschverfahren zur Untersuchung der Löslichkeit in einer wässrigen Lösung besteht aus drei Schritten. Es werden jeweils 4 Proben von mit Genipin vernetzten und nicht vernetzten Vliesstoffen mit einer Größe von 20 mm x 20 mm verwendet. Die Proben werden vor und nach jedem Schritt gewogen. Zunächst werden die Proben 20 Minuten lang in Ethanol gewaschen. Dann werden sie in einem Vakuumtrockenschrank (VT 6025, Thermo Scientific TM, Waltham, Deutschland) 24 Stunden lang bei 40 °C getrocknet. Anschließend werden die Proben separat in 15 ml PBS-Lösung (9,55 g PBS/l dest. Wasser) für 24 h eingelegt und anschließend bei Raumtemperatur für 72 h getrocknet.

2.1 Viskosimetrie

Die Polymerlösungen, die im Elektrospinnverfahren verwendet werden sollen, werden auf ihre Viskosität hin untersucht. Im Allgemeinen verhalten sich Polymerlösungen als nicht-newtonsche Flüssigkeiten, d.h. die Viskosität ist abhängig von der Scherrate, bei der sie gemessen wird. Die Messungen der Viskosität werden mit einem RheolabQC (CC27, Anton Paar, Graz, Österreich) durchgeführt. Die Viskosität (mPa∙s) wird bei Scherraten zwischen 50 und 1500 1/s an 200 Einzelpunkten im Abstand von 1,2 Sekunden gemessen. Anschließend werden die Ergebnisse in einem Diagramm aufgetragen, das den Trend der Viskosität in Abhängigkeit von der Scherrate darstellt.

2.2 Lichtmikroskopie

Die Durchmesser der Nanofasern werden mit dem Lichtmikroskop gemessen (Software: Leica Application Suite, Version 3.8.0, Mikroskop: DM4000 M, Leica, Wetzlar, Deutschland).

​​​​​​​2.3 Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie

Das Vorhandensein von Chitosan nach dem Elektrospinnen und Waschen der Proben wird mit einem Nicolet iS 10 FTIR-Spektrometer und der Software OMNIC Specta (beide Thermo Scientific TM, Waltham, Deutschland) untersucht. Der Transmissionsmodus wurde im Bereich von 600 bis 4000 cm-1 verwendet.

​​​​​​​2.4 Statistische Analyse

Die Daten von mindestens drei Exemplaren werden als Mittelwert und Standardabweichung angegeben. Jeder Versuch wurde zwei- oder dreimal wiederholt. Die statistische Analyse erfolgte durch einen Zwei-Wege-ANOVA-Test mit SPSS für Windows Version 11.5. Ein p < 0,05 wird als statistisch signifikant angesehen.

3. Ergebnisse

Lösungs- und Scaffold-Eigenschaften

Vier verschiedene Vliese wurden durch Elektrospinnen hergestellt. Die Konzentrationen und Verhältnisse der Polymerlösungen und der geeigneten Lösungsmittel sind das Ergebnis vorangegangener Experimente mit faktoriellem Design. Konzentrationen von Essigsäure zwischen 5 und 90 %, Gesamtpolymerkonzentrationen von 2, 3 und 4 Gew.-% und Polymerverhältnisse von Chitosan zu PEO von 7:3, 1:1 und 3:7 wurden hinsichtlich Löslichkeit und Verarbeitbarkeit bewertet. Experimente mit niedrigen Polymerkonzentrationen oder höheren Chitosankonzentrationen führten zu einem nicht stabilen Spinnprozess oder zum Versprühen der Lösung. Im Hinblick auf die Prozessstabilität und die resultierende Fasermorphologie zeigten Polymerlösungen mit 4 Gew.-% und einem Chitosan/PEO-Verhältnis von 3:7 in 70 %-iger Essigsäure die besten Ergebnisse und wurden daher für diese Studie ausgewählt.

 

Abbildung 1:             Viskosität von Chitosan/PEO-Lösungen mit einer Polymerkonzentration von 4 Gew.-% und einem Verhältnis von 7:3 im filtrierten (grau) und ungefilterten (schwarz) Zustand. Nach der Filtration sinkt die Viskosität aufgrund des Ausschlusses von Teilchen mit höherem Molekulargewicht.

Die Viskosität der endgültigen Lösung unterschied sich deutlich zwischen dem gefilterten und dem ungefilterten Zustand. Bei der ungefilterten Lösung ist die Viskosität im Bereich zwischen einer Scherrate von 50 und 1500 1/s deutlich höher (siehe Abbildung 1). Bei einer Scherrate von 100 1/s hat die ungefilterte Lösung eine Viskosität von 1087 ± 13 mPas und die gefilterte Lösung 635 ± 23 mPas. Bei 1500 1/s sinken die Werte auf 385 ± 34 mPas bzw. 285 ± 5 mPas.

Die Faserdurchmesser der aus ungefilterten Lösungen hergestellten Nanofasern betragen 573 ± 81 nm und die der Nanofasern aus gefilterten Lösungen 441 ± 132 nm. Der Unterschied zwischen den beiden Gruppen ist nicht signifikant, zeigt aber einen Trend. Abbildung 2 zeigt einen Unterschied in der Faserstruktur. Fasern aus ungefilterten Lösungen zeigen gerade Fasern, während Fasern aus ungefilterten Lösungen gekräuselte Merkmale aufweisen.

 

Abbildung 2:         Lichtmikroskopische Aufnahmen von elektrogesponnenen Chitosan/PEO-Nanofasern aus ungefilterter (links) und gefilterter (rechts) Lösung.

FTIR wurde verwendet, um das Vorhandensein von Chitosan in den Nanofaservliesen nach dem Elektrospinnen und Veränderungen in der Struktur nach dem Filtrationsprozess zu zeigen. In Abbildung 3 zeigt die Kurve des Chitosanpulvers (gepunktet) charakteristische Banden von Chitosan in einem Wellenzahlbereich von 3100 bis 3400 cm-1. Diese sind auf N-H- und O-H-Streckschwingungen und intermolekulare Wasserstoffbrückenbindungen der Polysaccharidmoleküle zurückzuführen. Die Peaks bei 1583 und 1649 cm-1 zeigen NH2 (Amid II) bzw. C=O-NHR (Amid I) an. Der Peak im Wellenlängenbereich von 2800 bis 3000 cm-1 wird der CH2-Streckung zugeordnet. [CMH+08; RVM+11]

Die Kurven „ungefiltert“ und „gefiltert“ zeigen die Messungen der elektrogesponnenen Proben. Die Kurvenformen der gefilterten und ungefilterten Proben zeigen keine signifikanten Unterschiede in den Peaks. Demnach hat die Filtration der Chitosanlösung keinen Einfluss auf die chemischen Strukturen. Die charakteristischen Peaks von Chitosan sind in den Kurven der elektrogesponnenen Proben zu finden. Die Intensität der CH2-Streckung bei 2861 cm-1 nimmt mit dem Zusatz von PEO zu. In ähnlicher Weise werden Peakverschiebungen im Vergleich zu Chitosan beobachtet. Die Schwingungsbanden bei 1583, 1649 und 3348 cm-1 sind zu 1562, 1663 und 3353 cm-1 verschoben. Diese Peakverschiebungen sind auf die Abnahme der intermolekularen Wasserstoffbrückenbindungen von Chitosan und die Bildung neuer Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Chitosan und PEO-Molekülen zurückzuführen [CMH+08]. Die FTIR-Ergebnisse zeigen, dass Chitosan in den elektrogesponnenen Vliesen vorhanden ist und dass es während der Filtration nicht entfernt oder beschädigt wird.

 

Abbildung 3:         FTIR-Ergebnisse für das reine Chitosan-Pulver und Chitosan/PEO-Nanofaservliese aus gefilterten und ungefilterten Spinnlösungen. Alle Kurven zeigen typische Peaks für Chitosan zwischen 3100 und 3400 cm-1. Leichte Verschiebung der Kurven für Fasern aufgrund des Einflusses von PEO auf Wasserstoffbrückenbindungen.

Löslichkeit in wässriger Lösung

Membranen ohne Genipin wurden während des Waschvorgangs vollständig aufgelöst. Sie konnten daher nicht weiter untersucht werden. Mit Genipin vernetzte Proben weisen nach dem Waschvorgang eine Farbänderung auf. Die Farbe ändert sich von einem hellen Weiß zu einem grün-blauen Farbton, wie in Abbildung 4 zu sehen ist. Dies ist auf die Chitosanderivate zurückzuführen, die durch die Reaktion von Genipin mit den Aminogruppen von Chitosan gebildet werden [MSS00].

 

Abbildung 4:         A) Chitosan/PEO-Nanofaser-Vliesstoff mit eingearbeitetem Genipin vor dem Waschvorgang, hellweiße Farbe. B) Chitosan/PEO-Nanofaservlies mit eingearbeitetem Genipin nach dem Waschvorgang, blau-grüne Verfärbung und leichte Verformung der Membran aufgrund der bei der Reaktion mit Genipin gebildeten Chitosanderivate.

Außerdem zeigen die Proben mit Genipin nach 24 Stunden in PBS und anschließender Trocknung eine Zunahme des Gewichts und des Faserdurchmessers, wie in Abbildung 5 dargestellt. Bei ungefilterten Proben beträgt die Gewichtsveränderung +33,9 ± 5,2 % und bei gefilterten Proben +46,2 ± 7,1 %.

 

Abbildung 5:         Links: Faserdurchmesser vor und nach dem Waschvorgang; Rechts: Massenänderung aufgrund der Quellung der Nanofasern

Der Faserdurchmesser im gequollenen Zustand beträgt bei ungefilterten Proben 901 ± 105 nm, was einer Zunahme von 60,9 ± 4,3 % entspricht. Bei gefilterten Proben beträgt der gequollene Durchmesser 705 ± 102 nm, was einer Zunahme von 52,2 ± 0,6 % entspricht.

 

Literaturliste

[CMH+08]          Chen, Zonggang; Mo, Xiumei; He, Chuanglong; Wang, Hongsheng
                            Intermolecular interactions in electrospun collagen–chitosan complex nanofibers
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